右归饮对牵张应力环境中成骨细胞碱性磷酸酶分泌的影响及其机制的实验研究

【摘要】目的明确序列酶消化法从乳鼠骨骼中分离培养骨细胞、成骨细胞在细胞形态学、细胞碱性磷酸酶(cAKP)染色、免疫细胞化学法骨钙素(BGP)染色及细胞碱性磷酸酶活性(ALP)测定上的差异。用右归饮含药血清对应力条件下培养的成骨细胞、骨细胞分别进行干预。观察应力环境中右归饮对成骨细胞ALP分泌和cAKP颗粒表达的影响,及其对骨细胞前列腺素E2(prostag-landinE2PGE2)、一氧化氮(NitricoxideNO)表达的影响。探讨右归饮在应力环境中调控骨细胞PGE2或NO分泌,进而影响成骨细胞ALP分泌的可能存在的机制。方法实验室条件下,采用序列酶消化法分别从3d龄SD乳鼠骨骼中分离培养骨细胞、成骨细胞,运用24h后细胞形态学观察,第一代细胞碱性磷酸酶(cAKP)染色、免疫细胞化学法骨钙素(BGP)染色,及细胞碱性磷酸酶活性(ALP)测定法,对骨细胞与成骨细胞的细胞形态、碱性磷酸酶和骨钙素分泌差异等特性进行鉴别比较。将两组细胞以2mL×2×105个的数量接种于力学加载培养板上,无血清同步化培养24h后分别予无血清培养基、右归饮含药血清培养基及生理盐水血清培养基,采用0.5HZ频率、12%形变量的牵张应力对实验组无血清培养细胞、含药血清培养细胞及生理盐水血清培养细胞进行力学加载,对照组常规条件下培养。分别于12h和24h对各组成骨细胞行碱性磷酸酶(ALP)定量测定,检测各组细胞ALP活性；加力24h后对成骨细胞行重氮盐法碱性磷酸酶(cAKP)染色,显微镜镜检拍照,检测成骨细胞胞浆内cAKP颗粒数目及分布；通过硝酸还原酶法、生物素双抗体夹心酶联合免疫吸附法(ELISA)对各组骨细胞24h后一氧化氮(NO)及前列腺素E2(PGE2)表达量进行检测。运用统计学软件对数据进行分析。结果观察示骨细胞多呈星状或树枝状,且有很多的突触；成骨细胞呈长梭形,有少量的突触。骨细胞碱性磷酸酶染色,胞浆内cAKP颗粒不明显；成骨细胞碱性磷酸酶染色,胞浆内可见众多cAKP颗粒。骨细胞BGP染色阳性明显,成骨细胞BGP染色阳性不如骨细胞明显。ALP在骨细胞中分泌较成骨细胞低,且有显著统计学差异。12%牵张应力环境中无血清组成骨细胞与常规培养条件下无血清组成骨细胞比较,前者ALP表达受抑制(P<0.05)；12%牵张应力环境中右归饮血清培养液与空白血清培养液,较常规培养条件下两种血清培养液比较,均能刺激成骨细胞ALP表达(P<0.05),且12%牵张应力环境中右归饮组ALP值高于空白血清组(P<0.05)。骨细胞在12%牵张应力环境中右归饮含药血清培养24h其NO表达显著高于对照组(P<0.05),各组PGE2表达无明显差异(P>0.05)。结论骨细胞在ALP表达、BGP分泌等方面与成骨细胞存在差异,12%牵张应力环境中右归饮能有效刺激成骨细胞ALP的表达,这种刺激作用的实现与其调控骨细胞NO形成存在联系。
【作者】汤小康；
【导师】肖鲁伟；童培建；
【作者基本信息】浙江中医药大学，中医骨伤科学，2014，硕士
【关键词】骨细胞；成骨细胞；牵张应力；碱性磷酸酶(ALP)；右归饮；一氧化氮(NO)；前列腺素2(PGE2)；

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